Исследование биологической активности пептидного комплекса IPH AEN в культурах хондроцитов крысы

Цель эксперимента – исследование хондропротекторных свойств пептида с условным названием IPH AЕN в культурах хрящевой ткани крысы. 


Задачи:


  1. Изучить действие IPH AЕN на экспрессию маркеров Ki67 (пролиферация) и p53 (апоптоз) в «молодых» («м») и «старых» («с») культурах хондроцитов крысы.
  2. Изучить действие IPH AЕN на экспрессию маркера ремоделирования межклеточного матрикса и активности хондроцитов ММР13 в «м» и «с» культурах хондроцитов крысы.
  3. Предположить процесс хондропротекторного действия IPH AЕN.


Материалы и методы исследования 


Исследовались диссоциированные культуры клеток хрящевой ткани крыс линии Вистар, 3 и 14 пассажи: 


  1.  – контроль (чистая культура);
  2.  – добавлен IPH AEN (20 нг/мл);
  3. – добавлен IPH AVN (20 нг/мл). 


При изучении хондропротекторных свойств IPH AЕN отрицательным контролем служил IPH AVN. Выбрали концентрацию 20 нг/мл, исходя из данных литературы. 


Культивировали до 3 пассажа и до 14 пассажа, на которых клетки были рассеяны на планшеты и произведено их иммуноцитохимическое окрашивание. 3 пассаж расценивали как «м» культуры, а 14 пассаж – как «с» культуры в соответствии с моделью клеточного старения пассажами. 


В работе исследовали пептиды IPH AVN и IPH AЕN как лиофилизированные порошки, разведенные питательной средой до 20 нг/мл. 


Культуры хондроцитов взяты из хрящевой ткани. Ткань хряща измельчалась и помещалась в 0,2%-й раствор коллагеназы NB4 на 30 мин при 37 °С. Клетки высаживались на культуральный пластик без подложки в ростовой среде DMEM/F12 с добавлением 10%-й фетальной бычьей сыворотки (foetal bovine serum, FBS, Autogene Bioclear), 100 Ед/мл пенициллина (Gibco), 100 Ед/мл стрептомицина (Gibco), 2 ммоль/л L-глутамина (Invitrogen). 


Сменяли среду через 3 суток. 


Общий вид культур хондроцитов крысы представлен на рисунке:


Рис. Первичная культура хондроцитов. Иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия


Для иммуноцитохимического исследования хондроцитов использовались антитела к Ki67 и р53 и маркер ремоделирования межклеточного матрикса и функционирования хондроцитов ММР13 (1 : 120).


Эти молекулы занимают важное место в функциональной активности хондроцитов:


  • Ki67 – маркер для оценки снижения пролиферации клеток и степени инволюции. 
  • Белок р53 – транскрипционный фактор, выполняет функцию супрессора образования злокачественных опухолей (за счет активации апоптоза в тканях организма). Активируется сигналами о нарушении активности клетки или во время старения. 
  • Матриксные металлопротеиназы (ММР) – семейство цинковых металлопротеиназ, участвуют в обмене белков межклеточного матрикса. Имеют высокую активность при остеоартрозе.


Препараты окрашивались согласно стандартному протоколу.


Морфометрия 


Использовался конфокальный микроскоп Olympus FluoView 1000, ПО Olympus FluoView ver 3.1b. Анализировалось 10 полей зрения при ×200. Для вычисления относительной площади экспрессии площадь иммунопозитивных клеток делили на площадь всех клеток в поле зрения и выражали в % (для маркера MMP13) и площадь иммунопозитивных ядер делили на общую площадь ядер в поле зрения (для маркеров р53, Ki67). 


Статистическая обработка результатов 


Проводили подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки в Statistica 6.0. Анализ вида распределения определяли по критерию Шапиро-Уилка. Критерий Стьюдента (различия в средних) использовали для данных с нормальным распределением. Для выявления неоднородных групп в значимо неоднородных выборках проводили множественные сравнения с помощью U-критерия Манна-Уитни. Критический уровень достоверности 0-гипотезы – 0,05.


Результаты исследования 


Иммунофлуоресцентным методом было показано, что площадь экспрессии Ki67 в контроле «м» культур (2,8 ± 0,3 %) в 1,8 раза больше, чем в «с» (1,6 ± 0,1 %) культурах. Под действием IPH AЕN экспрессия Ki67 в «с» культурах возрастает в 2 раза (график 1). 



График 1. Влияние пептидов на экспрессию Ki67 в культуре хондроцитов.


* – р < 0,05 по сравнению с контрольной группой «м» культуры;


** – р < 0,05 по сравнению с контрольной группой «с» культуры.


В «м» культурах пептид IPH AЕN достоверно не влиял на экспрессию Ki67. Пептид IPH AVN не оказывал влияния на экспрессию Ki67 в культурах хондроцитов (график 1). 


Тем же методом было показано, что площадь экспрессии р53 в контроле «м» культур (0,8 ± 0,1 %) в 4,6 раза ниже, чем в «с» (3,7 ± 0,6 %). Под действием IPH AЕN происходило снижение экспрессии р53 в «м» и «с» культурах в 1,8 и 2,1 раза. Под влиянием пептида IPH AVN наблюдалось повышение экспрессии р53 в «молодых» культурах хондроцитов в 1,5 раза. При этом пептид IPH AVN не влиял на исследуемый показатель в «старых» культурах (график 2).



График 2. Экспрессия р53 в культуре хондроцитов под влиянием пептидов.


* – р < 0,05 по сравнению с контрольной группой «м» культуры;


** – р < 0,05 по сравнению с контрольной группой «с» культуры.


Иммунофлуоресцентным методом было показано, что площадь экспрессии ММР13 в контроле «м» культур (0,3 ± 0,05 %) в 13 раз ниже, чем в «с» культурах (3,9 ± 0,7 %). Под действием IPH AЕN происходило снижение экспрессии ММР13 в «с» культурах в 2,7 раза. Пептид IPH AЕN не влиял на экспрессию ММР13 в «м» культурах хондроцитов. Пептид IPH AVN не влиял на исследуемый показатель в «молодых» и «старых» культурах хондроцитов (график 3). 



График 3. Влияние пептидов на экспрессию ММР13 в культуре хондроцитов.


* – р < 0,05 по сравнению с контрольной группой «с» культуры.


Данные о влиянии пептида IPH AЕN на экспрессию белков Ki67, p53, ММР13


Данные о влиянии IPH AЕN на экспрессию белков Ki67, p53, ММР13 в культурах хондроцитов при их старении могут играть важную роль в понимании молекулярных механизмов действия этого пептида при дегенеративных процессах в хрящевой ткани суставов. С возрастом процессы апоптоза (экспрессия р53) активируются, а процессы пролиферации (экспрессия Ki67) замедляются. Это один из факторов развития патологии опорно-двигательного аппарата при старении и у лиц, подвергающихся нагрузкам. То же мы наблюдаем и при старении хондроцитов в эксперименте. Пептид IPH AЕN стимулирует пролиферацию хондроцитов и снижает выраженность апоптоза в условиях клеточного старения. Пептид IPH AЕN, кроме того, снижает выраженность экспрессии ММР13, характерного для воспалительных заболеваний хрящевой ткани. Таким образом, пептид IPH AЕN может рассматриваться как вещество, потенциально перспективное в качестве хондропротектора.


Выводы


  1. При старении хондроцитов в культуре количество Ki67 снижается в 1,8 раза. IPH AЕN повышает экспрессию пролиферотропного белка Ki67 в «м» и «с» культурах хондроцитов в 1,7 и 2 раза. При старении хондроцитов в культуре производство р53 повышается в 4,6 раза. Пептид IPH AVN снижает экспрессию р53 в «м» и «с» культурах клеток в 1,8 и 2,1 раза.
  2. У стареющих хондроцитов в культуре экспрессия ММР13 возрастает в 13 раз. Под действием пептида IPH AЕN происходит снижение экспрессии ММР13 в «с» культурах в 2,7 раза.
  3. Стимуляция пролиферации (экспрессия белка Ki67), снижение выраженности апоптоза (белок р53) и ремоделирования межклеточного матрикса (экспрессия ММР13) под действием пептида IPH AЕN могут указывать на способность этого пептида предотвращать развитие дегенерации хрящевой ткани суставов.